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质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤​
发布时间:2020-06-14     作者:千亿官网app下载   点击量:

  质粒DNA的转化实践道理•、仪器试剂和操作程序_生物学_天然科学_专业材料。质粒 DNA 的转化实践道理●、仪器试剂和操作程序 【道理】 转化是将表源 DNA 分子导入到受体细胞,使之取得新的遗传特征的一种办法。转化所用的 受体细胞凡是是局部 - 妆点体例缺陷变异株,即不含局部!

  质粒 DNA 的转化实践道理、仪器试剂和操作程序 【道理】 转化是将表源 DNA 分子导入到受体细胞,使之取得新的遗传特征的一种办法。转化所用的 受体细胞凡是是局部 - 妆点体例缺陷变异株▪,即不含局部性内切酶和甲基化酶( R- , M- ) 。将对数滋长期的细菌(受体细胞)司理化办法解决后▼,细胞膜、的通透性爆发权且 性变化◁…,成为能愿意表源 DNA 分子进入的感觉态细胞。进入受体细胞的 DNA 分子通过复 造和表达实行消息的转化, 使受体细胞拥有了新的遗传性状。 将进程转化的细胞正在筛选培植 基上培植▷,即可筛选出转化子(带有异源 DNA 分子的细胞) ▪。 本实践采用 CaCl2 法造备感觉态细胞。其道理是细胞处于 0 ~4 ℃▽, CaCl2 低渗溶液中△, 大肠杆菌细胞膨胀成球状。 转化混淆物中的 DNA 变成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘 附于细胞表观,经 42 ℃ 90 秒热激解决,鞭策细胞汲取 DNA 得合物。将细菌就寝正在非选 择性培植基中保温一段韶华◁□, 促使正在转化经过中取得的新的表型■□, 如氨苄青霉素耐药 ( Amp r )取得表达▽,然后将此细菌培植物涂正在含 Amp 的挑选性培植基上,颠倒培植留宿,即可 取得细菌菌落。 本实践是将人 Bcl-2 重组质粒转化 DH5 α 扩增菌,转化后正在含 Amp 的培植基进取行筛 选,滋长的菌落即为含重组质粒的工程菌。 含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 α 菌用于质粒 DNA 的扩增▽,取得的质粒将行动局部性内切酶 的酶切底物 DNA ○。 【试剂与用具】 1 . LB 液体培植基 10g 胰卵白胨、 5g 酵母提取物▼、 10gNaCl 加水至 1L ▲,高压灭菌消 毒。 2 . LB 固体培植基 LB 液体培植基中加 1.5% 琼脂粉☆,高压灭菌消毒,待泠却至不烫手背 时铺培植皿•。 3 . 0◆◆.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌●。 4 .氨苄青霉素 用无菌水或心理盐水配造成 100mg/ml 溶液▽★,置 -20 ℃存在▲▷。 5 .人 Bcl-2 重组质粒 它是 Eco R Ⅰ单酶切的 pBluescript Ⅱ KS(-) 载体与 EcoR Ⅰ单酶 切的人 Bcl-2 cDNA 重组而成的,巨细为 4 861bp ,前者是一种由 pUC19 质粒衍生而来的 拥有 2 961bp 的质粒载体。于是用 Eco R Ⅰ酶切则应到空载 pBluescript Ⅱ KS(-) 载体 (2.96kb) 和人 Bcl-2 cDNA 片断 (1-◇.9kb) ▽◁。配造成 2g/1 μ l -。 6 .大肠杆菌 DH5 α 此为 DNA 扩增菌 7 .恒温水浴箱 8 .超净做事台 9 .高速冷冻离心绪 10 .恒温摇床 11 .恒温箱 12 .消毒离心管 13 .消毒 tips 14 .玻璃培植皿 直径 90mm 15 .玻璃涂布器 16 . 95% 乙醇 17 .标帜笔 【操作程序】 1 .细菌感觉态细胞的造备 将 DH5 α 菌种划线于 LB 琼脂板上★■, 37 ℃培植留宿●。挑取单菌落接种于 5ml LB 培植基 中…-, 37 ℃振荡培植培植留宿。越日取菌液 1ml 接种至含有 100ml LB 培植基的烧瓶中●…, 37 ℃激烈振荡培植至约 2 ~ 3h , 待 A 600 值到达 0.3 ~ 0.4 时将烧瓶置于冰浴 10 ~ 15min 。将细菌转化到一个灭菌解决过的冰预冷的 50ml 离心管中。 4 000 × g , 4 ℃ 离心 10min ,弃培植基,将管颠倒于滤纸使结果的残留液体流尽•。千亿官网app下载加预冷的已过滤除菌的 0.1mol/L CaCl2 重悬菌体,置冰浴 30min 。 4 000 × g , 4 ℃离心 10min ,弃培植基。 再加 4ml 预冷的 0.1mol/L CaCl2 ◁▪,轻轻重悬菌体,置 4 ℃冰箱 12 ~ 16h 。 2 . DNA 重组子的转化大肠杆菌 DH5 α 本实践中的 DNA 重组子为人 Bcl-2 重组质粒…。正在无菌条款下按每管取 200 μ l 新颖感觉 态 DH5 α 细菌置于无菌的 5ml 塑料离心管中◇◆,共 2 管,分散列入人 Bcl-2 重组质粒 (10ng) 和消毒水 ( 作阴性比照 ) 各 5 μ l , 轻轻挽回以混淆实质物, 正在冰上就寝 30min 。 42 ℃,热息克 90s ,半途不要摇动离心管,每管加 800 μ l 无抗生素的 LB 培植基●,于 37 ℃气氛摇床中以 150 r/min 速率振摇 45min ■●,使细菌苏醒△•。每管取 200 μ l 加至含氨 苄青霉素( Amp )的 LB 琼脂平板上★,用玻璃涂布器涂布匀称,室温就寝 20min ▷,使液 体汲取,然后 37 ℃颠倒培植 12 ~ 16h 至单菌落变成△。 【 属意事项 】 1 . 含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 α 菌落平板颠倒置于 4 ℃存在, 于下周举办质粒 DNA 的 造备。