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质粒转化大肠杆菌实验​
发布时间:2020-06-11     作者:千亿官网app下载   点击量:

  质粒转化大肠杆菌测验_医学_上等熏陶_熏陶专区。分子生物学经典测验,实质注意,供应给…:公共参考!

  测验 2 质粒转化大肠■”杆菌 目 的 1.重组质粒的判断 当质粒的重组或其它载体重组后,日常会发作质▲“粒的 重组曲折■•,囊括质粒的自己环化。所以恳求,举行筛选,把 重构成功的质粒寻找来。 正在目前常用的•◇。质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗 性基因☆◁,一朝重构成功,或者不含插入片断的质粒自己!环 化…▷,抗生素抗性▪:基因表达,被转化的大肠杆:菌便“具备抵造 相应抗生素的本领▲△,能够正在含该抗生素的提拔基上孕育传 代☆。否则=,借使重组曲折,大肠杆菌便不行抵造该抗生素 而逝世•■。 2.为扩增质粒和其它载体作盘算 因为大肠杆菌生息速◆▽,正在适宜的条目下生息一代仅需 要 20-30 分钟,并且常用质粒能够正在大肠杆菌中增殖到达 几百个拷贝。是以,通过对转化获胜的大肠杆?菌提拔☆◁,可 以正在短时,内极大地扩增主意质粒。 * 举、动分子生物学用大肠杆菌,是颠末测验室改造过 的工程菌。 原 理 本测验通过 CaCl2 对特定的大肠杆菌统治, 造备感触 态的细菌•。这些细菌可使每微克超螺旋质粒 DNA□,如极少 6 7 插入主意 DNA 片断的重组质粒,发作 5×10 -2×10 个转 化的菌落。 当质粒与这些大肠杆菌夹杂后,质粒粘附正在大肠杆 菌的表面,正在 42℃的温度时▷,大肠杆菌涌现热歇克•,质 粒可通、过大肠杆菌细胞▲?膜上变成的;空地进入菌体内。随 后□…,参与 LB :提拔液,于 37℃振动提拔可使细菌苏醒,并 且=○”表达质粒编”码的抗生素抗性基因=◆, 降低转化结果▼。 转化 获胜的大肠杆菌能够正在相应抗生素提拔皿中传代, 变成!菌 落。 测验盘算 (参考教材) 测验措施 自-70℃冰箱中取出感触态大肠杆菌,插入,千亿官网app下载湿冰中溶 解约 5 分钟,轻轻混匀▪。摄取 50ul -…;移入 1.5ml 管,并立时 将细菌放回-70℃冰箱○□。 细菌 50 ul DNA 5 ul 轻轻■、混匀◁,静置:冰上 30 分钟-▼。 于 42℃水、浴中热○?歇克细菌! 90 秒,速速。移入湿冰?中, 静置 2 分钟□☆,参与 900ul LB 提拔液☆,放入 37℃恒温箱摇 床,225rpm 摇晃提拔 1 幼时。取 100ul 涂?于含氨卞□?青霉素 的 L◆!B 琼脂平板皿上,待干燥后●,颠倒▷☆,存放于 ;37℃的培、 、养箱中住宿。 越日,查抄?各提拔皿中是否涌现菌落。 1■. 无菌落, 曲折▽。 或提拔△▷,条目不充、 ?分…-。 2□☆. 菌落布!满如“苔 样,曲折▼▷,大概 是●,抗生素=、浓度:不 够或?失“效▲。 3□. 菌落布▪▷。满,浓 度太”高,曲折。 4▪. 涌!现菌落,符 合▼△”恳求-○。 ;结果认,识及”统治方法 :1、有菌落□…,阐明转;化获胜,但有两种大?概性 □。其一,质粒自己环化☆◆;其二,重构成功。 2、无菌落,阐明?测验1,2中•●,起码▪;有一、个实 验!没有获胜。 3、菌落;布满如:苔样●,大概是抗◁?生素!浓度不”足 或失效○=。 4▷-、涌现•!大菌斑▼,民多是因-”为霉“菌污染所致▽。 提神事项 1.本测验采用的质粒含氨卞青霉素的抗性基因,所以 ☆;采用含氨卞青霉素琼“脂板作选…-、拔。常用的;抗性◆?基因再有四环 素、金霉素等,恳求真切以盘算适宜◇:的“抗生素板。 2.全部测验须端庄服从无菌操作恳求举行,因为琼脂 板含有抗生素,以是当测验情况洁净者,能够直接放正在日常 测验台上操,作。 3.接种环;或自造玻璃涂棒正在煤气灯上消毒后,须冷-●,后 方可”涂皿。关于“那些缺△,乏测验室阅历的斟酌职员,咱们倡议 采用成 L 型的自造玻璃涂棒,云云因为 L 型的下端与琼脂板 的接触面大•▷,不易将琼脂板,划破。 4.提拔皿,正在皿底作记号,写明实质○▼、日期、操作家等, 颠•-”倒放入提,拔箱。 5.?感触态大肠杆菌■◇;的造备: (1)正在无污染的条目下■☆,用 L;B 扩增大肠杆菌,并离心 收…,罗。 (2)!4℃条目下☆•,用 0.1 mol/L ▽,CaCl2 重悬重淀,再离 ▪☆,心重:淀,以洗去 LB 提拔液△▷。 (3)4℃条目下★-,用 0.1 mol/L CaCl2 重悬重淀,分装 •“备用■☆。 约莫 50ml: 的, LB 提拔液的,大肠杆菌, 溶于。 2ml ;的 CaCl2 8 中(每“ ml LB 提拔液约莫含 10 成活的大肠杆菌,LB 提拔的 !菌落恳求划皿约 16-20 幼时。的菌,落) ◁。 6.☆。正在造备感触态大肠杆菌及转化进程中,尽量不运用?玻 璃器:皿●◁,省得低落”转化结果★; 7.;运用新颖。造;备的感触态大肠杆;菌,有利于降低转化效 率▽; 8.正在全部测验进程中,要提神冰:上操作-▪。